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動物組織中DNA的制備實驗原理

2021-08-24 11:11 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
(一)原 理
DNA是所有生物體的基本組成物質。真核生物DNA主要存在于細胞核中。制備DNA時應將細胞核膜打破方能釋放出來。
細胞中的DNA和RNA分別與蛋白質相結合,形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細胞破碎后,這兩種核蛋白將混雜在一起。因此,要制備DNA首先要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度,如在0.15mol/L NaC1的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度最大,脫氧核糖核蛋白的溶解度則最?。▋H約為在純水中的1%);而在l mol/L NaCl的濃鹽溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度增大,至少是在純水中的2倍,核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據這種特性,調整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此,在細胞破碎后,用稀鹽溶液,反復清洗,所得沉淀即為脫氧核糖核蛋白成分。

分離得到的脫氧核糖核蛋白,用十二烷基硫酸鈉(SDS)使蛋白質成分變性,讓DNA游離出來,再用含有異戊醇的氯仿沉淀除去變性蛋白質。最后根據核酸只溶于水而不溶于有機溶劑的特點,加入95%的乙醇即可從除去蛋白質的溶液中把DNA沉淀出來,獲得產品。

當細胞破碎時,細胞內的脫氧核糖核酸酶(DNase)立即開始降解DNA,如果在破碎細胞后不及時采取抑制酶活的措施,最后將會得不到任何DNA。為此,如在本實驗中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除DNase必需的Mg2+離子,使DNase活性降低,并要求整個分離制備的過程均在4℃以下進行,以減少DNase的降解作用,最后加入SDS使所有的蛋白質(包括DNase)變性。當然如果希望獲得更大分子的DNA時,則在細胞破碎后,及時加入SDS使蛋白質(包括DNase)變性,并加入蛋白酶K,降解所有的蛋白質成為碎片或氨基酸,及時阻止DNase的降解作用。

DNA分子很大、很長,在水中呈黏稠狀,但DNA鏈的雙螺旋結構不宜小角度的折疊,使之DNA分子具有剛性,即分子是僵直的(stiff),小角度的折疊和壓擠等剪切力,將使DNA斷裂成碎片。為保證獲得大分子DNA,操作時應避免急裂振搖,或過大的離心力。轉移吸取DNA時不可用過細的吸頭,不可猛吸猛放,更不能用細的吸頭反復吹吸。

大分子DNA的水溶液呈黏稠狀,可以用玻璃棒纏起來。液體DNA只要防止DNase污染和高鹽濃度條件下能在液體狀態保存;抽干后的固體DNA,性質穩定,可長期保存。
生物體內各部位的DNA是相同的,但取材時以含量豐富的部位為主,如動物的肝臟、脾、腎、血液、精子等。所有材料,必須新鮮及時使用,或放入-20℃冰箱或液氮冷凍保存。
DNA的含量及純度可用紫外吸收法、定磷法及化學法等測定。

(二)試劑及器材
(1) 0.15mol/L NaCl – 0.015mol/L pH7.0檸檬酸鈉溶液:稱取8.77g NaCl,4.41g檸檬酸三鈉(Na3C6H507 · 2H20),用約800ml蒸餾水溶解后,調節pH至7.0,最后定容至1 000ml。
(2) 0.15mol/L NaCl – 0.1mol/L EDTANa2溶液:稱取8.77g NaCl,37.2g EDTANa2溶于約800ml蒸餾水中,以NaOH調pH至8.0,最后定容至1 000ml。
(3) 5%(W/V)十二烷基硫酸鈉(SDS)溶液:稱取5g SDS溶于45%(V/V)100ml的乙醇中。
(4) 氯仿– 異戊醇溶液:按氯仿:異戊醇=24:1配制。
(5) pH8.0 TE緩沖液或0.01mol/LNaOH:120mol/L Tris–HCl,lmol/L EDTANa2?;蛉aOH 0.4g加蒸餾水至1 000ml。
(6) 95%(V/V)乙醇1 000ml。
(7) 75%(V/V)乙醇1 000ml。
(8) 組織搗碎機。
(9) 玻璃勻漿器。
(10) 冷凍離心機。
(11) 冰、粗鹽。

(三)操作
(1) 本實驗以兔肝臟作材料(其他動物肝臟也可以)。實驗前應將兔饑餓24h以上,以避免糖原的干擾。
(2) 用燒杯(500m1)放1/3體積的冰,加入少量水及約20g食鹽,制成冰鹽水。
(3) 將經過饑餓的兔頸部放血致死,迅速開腹取出肝臟,稱取約10g浸入預先在冰鹽水中冷卻的0.15mol/L NaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液中。除去脂肪、血塊等雜物;再用少量溶液反復洗滌幾次,直至組織塊無血為止。
(4) 將洗凈的組織剪成碎塊。先加入20m1 0.15mol/L NaCl–0.015mol/L檸檬酸鈉溶液,放在組織搗碎機中迅速搗成勻漿,再放入玻璃勻漿器中勻漿2~3次,使細胞充分破碎。最后加入0.15mol/L NaCl–0.015mol–L檸檬酸鈉溶液至50ml。
(5) 勻漿液在4℃ 6 000r/min離心15min,棄上清。在沉淀中加入4倍體積冷的0.15mol/L NaCl–0.015 mol/L檸檬酸鈉溶液,攪勻,按上述條件,離心棄上清。如此重復操作2~3次,盡量洗去可溶的部分(目的是什么?)。最后棄去上清,留沉淀。
(6) 將沉淀物(約5m1)懸浮于5倍體積的pH8.0,0.015 mol/L NaCl–0.1 mol/L EDTANa2溶液中,攪勻,而后邊攪拌邊慢慢滴加5%SDS溶液,直至SDS的最終濃度達1%為止(應加多少毫升?),此時溶液變得十分黏稠,若不黏稠應重做,然后,加入固體NaCl使最終濃度達l mol/L。繼續攪拌30~45min,以確保NaCl全部溶解,此時可見溶液由稠變稀薄。
(7) 將上述混合溶液倒于一個300ml的帶塞三角瓶中,加入等體積的氯仿– 異戊醇,振蕩10min。在室溫3 000r/min離心10min(為什么可以在室溫操作?),此時可見離心液分為3層:上層為水溶液,中層為變性蛋白塊,下層為氯仿– 異戊醇。小心吸取上層水相,記錄體積,放入三角瓶中,向水相中,再加入等體積氯仿– 異戊醇,振蕩,離心,如此重復抽提2–3次,除凈蛋白質。
(8) 最后1次離心后,小心吸取上層溶液(不要吸取下層氯仿),記錄體積,放入干燥小燒杯中,加入2倍體積預冷的95%乙醇。加時,用滴管吸取乙醇,邊加邊用玻璃棒慢慢順一個方向在燒杯內轉動,隨著乙醇的不斷加入可見溶液出現黏稠狀物質,并能逐步纏繞于玻璃棒上,此時玻璃棒攪動的目的在于把黏稠絲狀物纏在玻璃棒上,直至再無黏稠絲狀物出現為止。黏稠絲狀物即是DNA。
(9) 將所得的DNA從玻璃棒上取下,用75%乙醇洗2次,置于干燥器中抽干,稱取重量,計算產率。
(10) 按200μg/ml的濃度稱取一定量DNA,溶于0.01 mol/L NaOH溶液或pH8.0 TE緩沖液中(干燥DNA不易溶解,應在測定前幾天預先溶解)。
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