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原代細胞獲取和培養——科研人分享!

2021-08-16 10:55 作者:洛辰 來源:上海遠慕生物試劑
說到細胞,我想大家應該都不陌生。我們最初了解細胞這個名詞應該是在初中高中的生物課本上。我們也都知道,我們的生命體都是由細胞這個微小的單位組成(病毒除外)。

作為一個科研狗,拿到一管細胞后我們想到更多的是:這是什么細胞(動物的?植物的?)?原代細胞?還是細胞系?或者說,這細胞是貼壁生長的?還是懸浮生長的?那么我們今天就來聊聊什么是原代細胞。

原代細胞(primary cell):是指從機體的組織(如人組織、小鼠組織、大鼠組織和兔組織等)經蛋白酶或其它的方法獲得單個細胞并在體外進行模擬機體培養的細胞,稱為原代細胞。一般認為,培養的原代的第1代細胞和傳代到第10代以內的細胞統稱為原代細胞培養。

在我們的科學研究過程中,每個涉及到細胞研究的研究者都會根據自己的實驗需求采用不同的細胞。根據自己的課題采用原代細胞或者細胞系,我們都知道,細胞系的培養相對于原代細胞來說更為的簡單和易操作,也不會擔心細胞在正常條件下會發生分化、衰老等現象從而影響我們實驗的可信性和重復性。而原代細胞從獲取到培養整個過程要考慮的問題則非常多,接下來我們就具體聊聊吧。


一、原代細胞的獲取

原代細胞的獲取,就是從活體上將組織分解成單個細胞再進行培養的過程,且整個過程要求無菌操作。具體要考慮的問題有:組織分解的方式,培養的時間,換液時間,細胞狀態判斷和凍存。

組織分解方式

將組織分解成單個細胞的方式目前主要有兩種:酶消化法和組織塊法(針對貼壁細胞)。

【1】酶消化法:所用試劑:膠原酶和胰酶。

膠原酶的選擇:(根據自己的組織樣本選擇合適的膠原酶是實驗成功的大前提。)

類型

適用組織

膠原酶Ⅰ

上皮、肺,脂肪和腎上腺組織細胞的分離.

膠原酶Ⅱ

軟骨,肝臟,骨,甲狀腺,心臟和唾液腺組織細胞的分離。

膠原酶Ⅲ

消化組織中連接部分使其成為單個細胞,用于哺乳動物組織細胞解離

膠原酶Ⅳ

多種組織。

膠原酶Ⅴ

胰腺小島組織的分離,將結締組織分離成單個細胞。

膠原酶的配制:建議看相關的文獻進行膠原酶的配制。小編常用的是DMEM進行配制,配制好的膠原酶消化液放置在37℃水浴鍋內預熱(注意現用現配)。

胰酶(酶聯合法獲取原代細胞中會加入胰酶)

膠原酶消化時間:根據組織特性,消化時間會有差異。以小鼠腎細胞為例,加入膠原酶Ⅰ進行消化后,放入37℃培養箱中消化45min~1h左右,期間每隔10min中震蕩一次,知道組織塊幾乎完全消失為止(若是組織塊剪得非常細小,時間可以短一些,30min左右即可)。

培養過程:注意原代細胞在培養2天后可能會出現細胞液變黃(橘黃色)的現象,且無漂浮物,這是正?,F象哦,不是污染。這是由于細胞在貼壁生長過程中釋放了CO2和其他物質導致培養液PH發生了改變,所以變黃。

【2】組織塊法

取材:取組織中間部位,剪成大小均勻的小方塊(1~4mm2),清洗干凈后轉移至培養皿中,在培養皿中各組織塊要排列均勻。

加液:培養液不能浸沒組織塊,避免組織漂浮。然后培養4h左右加培養液,培養48h后換液。

培養時間

無論是酶消化法還是組織塊法,取樣后培養時間最少需要一周以上的時間,期間可換液或者傳代。

換液時間

無論酶消化法還是組織塊法,在培養期間需要隨時關注細胞的生長狀況,需觀察其是否貼壁,是否污染,組織塊法要觀察是否有細胞遷移出來。正常情況下48~72h可換液一次。

細胞狀態判斷

正常貼壁細胞在培養幾天后,會逐漸貼滿整個瓶底或者皿底,有的呈纖維狀,有的呈多邊形。下圖均為比較健康的原代細胞圖(左:小鼠成纖維細胞;右:雞胚成纖維細胞;下:人成纖維細胞)

這些細胞的狀態比較好,生長至80%~90%融合就可以傳代啦,傳代一次后的細胞會更干凈漂亮。

凍存

傳一代后的細胞(也可以不傳代直接凍存)培養至80%~90%便可凍存起來供后續實驗用。

凍存液配制:不同的細胞可能會有不同的凍存液配制方案,各實驗室也有自己的凍存方案,常見的方案有:

A: 10%DMSO+90%的FBS

B: 10%DMSO+40%FBS+50DMEM

C: 5%DMSO+45%DMEM+50%FBS (小編常用小鼠的,鹿的都嘗試過,細胞狀態OK)

二、原代細胞的培養

原代細胞的培養其實與細胞系的培養無多大差別,針對不同的細胞會選擇不同的細胞培養液。

1.培養液選擇:(根據不同的細胞類型和實驗要求進行培養液的選擇)

最chang用的L/H DMEM,F12 DMEM,RPMI 1640。

2.細胞培養過程無菌操作。正常的復蘇,換液和傳代操作,最后將培養好的細胞進行相應的實驗即可

3.細胞鑒定。有時候我們獲取的原代細胞可能會有不是自己期望的細胞在里面,或者獲取的不是我們的目標細胞。這個時候我們需要進行細胞的鑒定。細胞鑒定需要購買特定細胞的表面標志物抗體或者染色試劑進行鑒定。

三、原代細胞試用的實驗類型

前面我們了解了原代細胞獲取和培養過程中應該注意的一些細節,這有助于我們培養我們的原代細胞。那么原代細胞培養好后,它可適用哪些研究呢?

原代細胞不僅廣泛應用于分子、細胞生物學和生物醫學基礎研究,如蛋白質組學、基因組學、細胞株(系)研究、DNA,RNA和遺傳學研究等,還可應用于當今熱門的生物醫藥產業如藥物篩選、藥物代謝和毒理研究、癌癥藥物的研究等。在這些應用中幾乎都涉及了幾個最常見的且最基礎的細胞實驗,如下:

細胞增殖檢測:

常見檢測方法:CCK8檢測法 ,MTT檢測法,Brdu檢測法,Edu檢測法,平板克隆形成

細胞周期檢測

常見檢測方法:流式檢測細胞周期,標記有絲分裂百分率法

細胞凋亡檢測

常見檢測方法:流式檢測細胞凋亡,線粒體膜電位,活性氧檢測,Hoechst染色,電鏡,TUNEL

細胞轉移能力檢測

常見檢測方法:細胞劃痕實驗,Transwell實驗,Invasion實驗
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